丙酮酸檢測試劑盒(*肼微板法)說明書

丙酮酸檢測試劑盒(*肼微板法)

一、產品簡介：

丙酮酸(Pyruvic acid，PA)又稱2-氧代丙酸，是參與整個生物體基本代謝的中間產物之一，可通過乙酰輔酶A和三羧酸循環實現體內糖、脂肪和氨基酸間的互相轉化，丙酮酸在三大營養物質的代謝聯系中起著重要的樞紐作用。丙酮酸是糖無氧代謝的產物，科研工作者常將丙酮酸和乳酸一起研究，并用二者的比值推算循環衰竭的程度。丙酮酸檢測可采用乳酸脫氫酶催化法或*肼比色法。

雅吉生物丙酮酸檢測試劑盒(*肼微板法)檢測原理是在酸性條件下,丙酮酸與*肼反應，生成丙酮酸-*腙復合物，后者經氧化呈棕紅色，通過酶標儀測定520nm處吸光度，據此通過與標準曲線對比可以計算出PA水平。該試劑盒可用于檢測植物、細胞或組織、血清等樣品中內源性的丙酮酸含量,尤其適用植物樣品丙酮酸含量的檢測。該試劑盒僅用于科研領域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

二、產品組成：

三、自備材料：

1、離心管或小試管

2、蒸餾水

3、酶標儀、96孔板

四、操作步驟(僅供參考)：

1、配制組織勻漿液(1×)∶取10ml組織勻漿液(3×)加入20ml蒸餾水即成。

2、配制PA Assay Buffer (1x)∶取10ml PA Assay Buffer (1.5×)加入5ml蒸餾水即成。

3、準備樣品︰

①血清、尿液及其他體液樣品:血清按照常規方法制備后可以直接用于本試劑盒的測定，尿液通常也可以直接用于測定，-20°C凍存。

②組織樣品︰稱取1g組織樣品置于勻漿器中，再加入1ml組織勻漿液(1x)仔細研磨，振搖提取靜置30min ,取上清液4000rpm離心10min ,取上清液,用組織勻漿液(1×)定容至2ml , -20℃凍存，用于PA的檢測。

③植物材料︰稱取1g植物材料置于勻漿器中，再加入1ml組織勻漿液(1×)仔細研磨，振搖提取,靜置30min ,取上清液4000rpm離心10min ,取上清液,用組織勻漿液(1×)定容至2ml , -20℃凍存，用于PA的檢測。

④高濃度樣品:如果樣品中含有較高濃度的PA，可以使用原有的裂解液或PBS等進行稀釋，如雞血清可稀釋5～10倍后檢測。

4、配制標準品工作液︰如果檢測血清、尿液等樣品，按取丙酮酸標準(6mg/ml):蒸餾水=1：99的比例配制，使濃度達到60μg/ml，如果檢測組織樣品按丙酮酸標準(6mg/ml) :組織勻漿液(1×)=1:99的比例配制，使濃度達到60μg/ml。

a、檢測血清、尿液等樣品時，用96孔板按下表操作:

b、檢測組織樣品時，用96孔板按下表操作:

5、PA加樣︰按照下表設置空白孔、標準孔、測定孔，溶液應按照順序依次加入，并注意避免產生氣泡。如果樣品中的PA濃度過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定，樣品的檢測最好能設置平行管。

a、檢測血清、尿液等樣品時，用96孔板按下表操作:

b、檢測組織樣品時，用96孔板按下表操作︰

6、PA測定∶混勻靜置10min，其中空白孔呈無色或淡黃色，標準孔依次呈不同程度的棕紅色。以空白孔調零，酶標儀520nm讀取標準孔、測定孔的吸光度值(記為A_標準、A_測定)。

計算：

以各丙酮酸標準濃度(1~6號)為橫坐標，以對應各丙酮酸標準A_標準為縱坐標，繪制丙酮酸標準曲線，血清、尿液等的丙酮酸含量直接根據標準曲線求得。

組織丙酮酸(μg/g)=A×N/m

血清丙酮酸(μg/ml)=A×N

式中:

A=通過標準曲線計算樣品的丙酮酸濃度(μg/ml)

N=稀釋倍數

m=樣品的質量(g)

注意事項:

1、所加試劑順序不可顛倒，先加丙酮酸標準液或待測液，再加組織勻漿液(1×)，最后加PA Assay Buffer(1×)。

2、配制的丙酮酸標準(60μg/m)應4°℃避光保存，24h 有效。

3、組織勻漿液有腐蝕性，應小心操作。

4、健康成年人空腹靜脈全血丙酮酸含量為3~9μg/ml。

5、如果沒有酶標儀，也可以使用分光光度計測定，檢測樣品量會相應減少。

6、標準曲線的各點應分布均勻，范圍適中。

7、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期:6個月有效。4C運輸，4°℃保存。