Equine Herpesvirus 5 (EHV-5)馬皰疹病毒5型染料法熒光定量PCR試劑盒應(yīng)用

背景：皰疹病毒(herpes virus)是一群有包膜的DNA病毒，生物學(xué)特性相似，歸類(lèi)為皰疹病毒科(Herpesviridae)。其感染宿主廣泛，主要侵害皮膚、黏膜以及神經(jīng)組織，嚴(yán)重影響著人及其他動(dòng)物的健康。馬可能感染多種皰疹病毒。最常見(jiàn)的與感冒病毒相似，易致呼吸困難。馬皰疹病毒4型(EHV-4)也稱(chēng)馬鼻肺炎病毒，主要引起呼吸系統(tǒng)疾病。因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。

產(chǎn)品及特點(diǎn)    

本產(chǎn)品是根據(jù)探針?lè)晒舛?/span> PCR 原理開(kāi)發(fā)的檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物等組分經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏度高。

3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)中間普雷沃菌 DNA 序列高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物樣本的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。

6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針?lè)晒舛?PCR 反應(yīng)。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研

使用方法：

一、DNA 提取(樣本制備區(qū))

用自選方法提取純化樣品DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。

二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))

 （由于陽(yáng)性對(duì)照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，避免污染樣品或本試劑盒的其他成分）。

1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL DEPC-H2O，（最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

若無(wú)需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將陽(yáng)性對(duì)照稀釋到1×10E5拷貝/μL即可。

三、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

若有N個(gè)待檢樣品，準(zhǔn)備N(xiāo)+2個(gè)qPCR管(N個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對(duì)照+6個(gè)陽(yáng)性對(duì)照)，向各PCR管中分別加入下列成分(見(jiàn)詳細(xì)說(shuō)明書(shū)，可向我司索取)

轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)。

四、添加模板(模板添加區(qū))

向qPCR管中分別加入2ul模板，加樣順序?yàn)殛幮詫?duì)照（DEPC-H2O）、待測(cè)樣品模板、嬰兒利什曼蟲(chóng)qPCR陽(yáng)性對(duì)照，離心30秒，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

五、擴(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))

將PCR管放置在PCR擴(kuò)增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：(見(jiàn)詳細(xì)說(shuō)明書(shū)，可向我司索取)

六、結(jié)果分析

1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log 值為橫軸，以Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的log 值，推算出其濃度。

2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：

陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果：Ct 值<30，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，呈典型的S 型曲線。

陰性對(duì)照結(jié)果：Ct 值>38 或無(wú)Ct 值，無(wú)明顯指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。

樣本檢測(cè)結(jié)果：Ct 值<35，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，表明樣本中檢測(cè)出嬰兒利什曼蟲(chóng)，結(jié)果為陽(yáng)性；Ct 值>38 或無(wú)Ct 值，表明樣本中未檢測(cè)出嬰兒利什曼蟲(chóng)，結(jié)果為陰性；Ct值在35-38 范圍，應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)檢，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct 值仍在35-38 范圍，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽(yáng)性對(duì)照需要單獨(dú)放置，不要污染其他試劑。