細胞凋亡形態學檢測方法

細胞凋亡的早期形態學改變是核染色質濃聚、固縮,聚集在核膜周邊，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細胞核裂解成若干碎片，細胞膜將胞質和染色質斷片包裹，胞漿內形成多個膜結構尚完整的“小泡"及 “凋亡小體" (apoptoticbody)。這不同于細胞壞死的細胞腫脹、胞膜破裂、細胞崩解。
       根據凋亡細胞固有的形態特征，至今為止，已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。

       一、光學顯微鏡觀察

       凋亡細胞的主要特征為核染色質致密深染，形成致密質塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應。
本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復性差。本方法可用于調亡現象的初步觀察，作為分析指標之一。
       檢測方法：細胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細胞的形態改變，結合顯微測量工具可作凋亡細胞計數。
       二、視頻時差顯微技術
       此方法用于細胞培養，通過相差顯微鏡可動態觀察細胞凋亡的變化過程，尤其是觀察細胞表和外形的變化。凋胞與基質分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細胞拉長，出現釘狀突起，特續數小時后細胞膜破裂，細胞溶解，通過連續觀察，本方法可養壑培養中的凋亡細胞，但不能用于病理組織。
       檢測方法：收集2×105細胞/ml培胞，置于多孔培養板，加入凋亡誘導劑，在帶有自動攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細胞的動態改變，每隔分鐘30秒作序列攝影，連續24小時。如同進進行熒光染色，可參熒光晃微鏡下觀察和攝影。
       三、電子顯微鏡觀察

雖然光學顯微鏡下可以看見胞膜起泡現象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態學變化大多發生在超微結構,因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結構在凋亡不同時期的變化。電鏡形態學觀察是迄今為止判斷凋亡可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。

       缺點：
       (1)只能定性,不能定量;
       (2)標本處理過程復雜,設備相對昂貴,對檢查者的技術水平要求較高,不適于大批標本檢測;
       (3)在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現染色質濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。
       檢測方法：透射電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。
       四、流式細胞技術
       流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結構的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細胞大小、體積相產，右向角射光的強度與細胞結構的析射性、顆粒性（granu-larity）有關。
       細胞凋亡過程中出現的形態改變如細胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發生改變。早期凋亡細胞主要表現為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細胞的皺縮，后者反映了細胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。
       由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數的檢測結合起來才能準確地辨認凋亡細胞。
       細胞凋亡過程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發現在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。
       根據此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質比例等方法辨認凋亡細胞。
       檢測方法：獲取密度1×106細胞/ml左右的細胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細胞儀分析。