pCR-BluntII-TOPO-WNT3A(human)大腸桿菌實驗過程

名稱pCR-BluntII-TOPO-WNT3A(human)

別稱BC103921.1

基因長1158bp

質粒宿主大腸桿菌

質粒用途基因模板

片段類型cDNA

片段物種人

原核抗性Kan

篩選標記

熒光標記

啟動子

復制子pUC

感受態DH5a

溫度37度

背景載體

正向引物M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

反向引物M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

拷貝數

產品規格：0.5ug質粒干粉
       收到產品后，請先根據產品管壁標簽來判斷產品形式，并在擴增前準確查找該質粒菌株的抗性、感受態和培養溫度。
pCR-BluntII-TOPO-WNT3A(human)質粒擴增流程
收到產品后，請先根據產品管壁標簽來判斷產品形式，并在擴增前準確查找該質粒菌株的抗性、感受態和培養溫度。
1、質粒干粉（常溫運輸，存于-20度，90天保質期，請務必轉化挑單克隆培養，不要直接使用和測序）
①收到質粒干粉后請先5000rpm離心1min，再加入20μl ddH2O去離子水溶解質粒；
②取1支100μl 感受態于冰上解凍10min，加入2μl質粒，再冰浴30min后，42℃熱激60s，不要攪動，再冰浴2min；（從第二步開始均要在超凈工作臺中無菌操作）
③加入900μl無抗的LB液體培養基，180rpm震蕩37℃培養45min；
④6000rpm離心5min，僅留100μl上清液重懸細菌沉淀，并涂布至目標質粒抗性的LB平板上；（可使用本平臺的平板涂布專用玻璃珠進行涂布，可以比傳統涂布方法獲得更多轉化子）
⑤將平板正向培養1h，再倒置37℃培養14h。如果要求是30度則培養20h，（菌落過多則將質粒稀釋后再轉化。沒有菌落則加入10μl質粒轉化。另不要直接轉表達感受態，要先轉克隆感受態，重提質粒后再導入表達感受態）
⑥挑取單菌落至LB液體培養基中，加入對應抗生素，220rpm震蕩培養14h，根據實驗需要和質粒提取試劑盒說明書提取質粒。
2、甘油菌種（冰袋運輸，存于-80℃，保質期90天，請務必劃線挑單克隆培養）四區劃線后挑單菌落培養，酵母菌需要先液體復蘇再四區劃線，再挑單菌落液體培養。
3、穿刺菌種（冰袋運輸，存于4℃，保質期7天）穿刺接種，液體培養后四區劃線，再挑單菌落液體培養。
4、菌落平板（冰袋運輸，存于4℃，保質期7天）直接挑取單菌落至液體培養基中。
5、液體質粒（冰袋運輸，存于-20℃，保質期90天）單獨提取的液體質粒收到后可直接使用。
6、濾紙質粒（常溫運輸，存于-20度，90天保質期，請務必轉化挑單克隆培養，不要直接使用和測序）
收到貨后將濾紙畫圈部分剪下放入EP管中，加100ul無菌水將濾紙浸濕并浸泡5min，吸取5ul質粒轉化，離心全涂。
轉化圖片：

pCR-BluntII-TOPO-WNT3A(human)質粒提取步驟：（本步驟僅做示例，非該產品實際提取步驟）
實驗原理：
        堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA 與線性染色體DNA 在拓撲學上的差異來分離它們。在pH 值介于12.0 ～12.5 這個狹窄的范圍內，線性的DNA 雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環質粒DNA 的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。當加入pH 4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH 至中性時，共價閉合環狀的質粒DNA 的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA 的兩條互補鏈彼此已分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA ，蛋白質-SDS 復合物等一起沉淀下來而被除去。
二、操作步驟：
        1. 準備20ml滅菌過的培養管，編號，分別加入8ml LB培養基，再加入8µl 相應抗生素，可適量多加；
        2. 用10µl 白色槍頭挑取挑取單個菌落至培養管中，37℃震蕩過夜（274rpm）；
        3. 取2ml過夜培養的菌液加入離心管中，室溫10000rpm離心2min，去上清；（可重復步驟2，直至菌液離心完）（去上清時用紙吸一下）
        4. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250µl Buffer P1（含RNase A），使用移液槍充分混勻，懸浮菌體菌體；
        5. 向離心管中加入250µl Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻4~6次，獲得澄清的裂解液；（劇烈混合會使剪切染色體DNA，降低質粒純度）
        6. 向離心管中加入350µl Buffer N3， 立即溫和地上下顛倒混勻4~6次，此時出現白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心15min；
        7. 小心將步驟6中所得的上清液轉移至潔凈的吸收柱中。要保證沒有吸入沉淀和細胞碎片。室溫10000rpm離心1min，至裂解物通過吸收柱,倒掉收集管中的廢液；
        8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；
        9. 向吸附柱中加400µl  Buffer PW（檢查是否加入無水乙醇），10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。再空離一次，2min（此時可以加熱 Buffer EB，65~70℃）；
        10. 將吸附柱置于一個新的離心管中，打開蓋子，吹風4min左右（確保乙醇被去除，乙醇會影響下面的步驟）；
        11. 向吸附柱的吸附膜中間部位加90µl Buffer EB（pET系列拷貝數低，加EB 70μl即可），室溫靜置2min。10000rpm離心1min；
        12. 把液體倒回吸附柱，在10000rpm離心1min；
        13. 混合質粒至一個離心管中，做好標記，開蓋室溫放置兩小時左右。-40℃保存質粒。
三、注意事項：
        1.使用之前，把試劑盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。
        2.Buffer EB在65~70℃水浴預熱，可以增加提取效率。
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