PCR假陰性——不出現擴增條帶及對策

假陰性，不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質

②模板中含有Taq酶抑制劑

③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白

④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹di。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，

對策為：

①選定一個好的引物合成單 位。

②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。

④引物設計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul.或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出 現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。